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          威斯騰公眾號

          成功案例
          基因敲除小鼠的繁育鑒定

          時間:2020-08-05 10:38:00 瀏覽:3693次



          1. Product Information

          Name

          C57BL/6-XXXtm1cyagen

          Serial Number

          KOCMP-21018-XXX

          Gene

          XXX

          NCBI ID

          18024

          Strain

          C57BL/6

          Type

          conventional knockout

          2. gRNA target sequence

          gRNA1 (matching forward strand ofgene): CAGCCCTTGGTTAGCAGCGCAGG

          gRNA2 (matching forward strand of gene): TTCTATACTAAACGTTAGCTAGG

          3. Delivery Information

           4. Genotyping Strategy

          5. PCR Screening

          Animals 2 and 6 were identified positive by PCR screening.

          Note:

          1)PCR was carried out in 25 μL volume for 35 cycles under standard conditions, with primers listed above added to each reaction.


           2) Taq DNA polymerase used was P112-01.



           3) Two controls used in PCR genotyping are:


           ? Water control: No DNA template added.


           ? Wildtype control: 400 ng of mouse genomic DNA.  



          6. Sequencing Confirmation


          Sequencing Primer for PCR product:

          Sequence primer (F1): 5’-GAAGCATTATCATTTGGTGGGAAC-3’


          Sequencing Results:


          Positive animals

          Mouse ID: 2, 6 (Deleted 4961 bp and inserted 28 bp)

          7. Breeding and Genotyping strategy

          8. 配種與繁殖匯總

          小鼠配種與繁殖情況如下圖所示。

          1+/+DNA雙鏈都含有XXX基因,即野生型小鼠;+/-為只有一條DNA鏈含有XXX基因,即雜合子小鼠;-/-DNA雙鏈都不含XXX基因,即純合子小鼠。

                 (2)紅色字體標記表示純合子小鼠,藍色字體標記表示小鼠已死亡。

                PCR鑒定

               (1)5/9,2#,6#鑒定。

               根據圖一,說明:2-1、6-1用引物F1/R1進行PCR;2-2、6-2用引物F1/R2進行PCR。鑒定結果:2#,6#為雜合子。

                (2)5/19,7#~13#鑒定。

                 根據圖二,說明:前面是用引物F1/R1進行PCR;后面是用引物F1/R2進行PCR。鑒定結果:7#、9#、10#為純合子;11#、12#、13#為雜合子;8#為野生小鼠。其中11#引物F1/R1條帶不明顯,后續重新取材鑒定。

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